代謝組學(xué)研究中，差異代謝物的篩選是數(shù)據(jù)分析重要的一環(huán)，但由于代謝組數(shù)據(jù)具有多維且某些變量間高度相關(guān)的特點(diǎn)，所以分析方法有很多，如PCA、PLS-DA以及OPLS-DA分析等。

　　1. 代謝組學(xué)常用的顯著性檢驗(yàn)方法：

　　p值是一個(gè)概率，反映某一事件發(fā)生的可能性大小，用于區(qū)分該變量是否具有統(tǒng)計(jì)顯著性，通常認(rèn)為p<0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。常用的檢驗(yàn)方法有t-test、方差分析(Analysis of Variance， ANOVA)。t檢驗(yàn)一般適用于兩組差異比較，在多維的情況下就要用到ANOVA方差分析。

　　2. 單變量分析方法-差異倍數(shù)分析在代謝組學(xué)兩兩比較中是較為常見的，但多組比較為什么沒有呢?

　　差異倍數(shù)(Fold Change，簡稱FC值)分析即根據(jù)代謝物的相對定量或絕對定量結(jié)果，計(jì)算某個(gè)代謝物在兩組間表達(dá)量的差異。差異倍數(shù)作為上下調(diào)的一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)，假設(shè)比較組為AvsB，計(jì)算方式為：FC=B/A，F(xiàn)C大于1為上調(diào)，小于1為下調(diào)(這個(gè)標(biāo)準(zhǔn)不是固定的，也可以設(shè)置的更為嚴(yán)格一點(diǎn)，比如調(diào)整為1.2倍、1.5倍或者2倍，這三種閾值在代謝組研究相關(guān)文章中是較為常見的)。我們說上下調(diào)，一般都是指和某一組相比，另一組上調(diào)或者下調(diào)，三組或者多組的時(shí)候是無法定義和哪組相比其他幾組高或者低的，因此差異倍數(shù)是在兩兩比較中產(chǎn)生的。

　　3. 多元統(tǒng)計(jì)分析

　　多元統(tǒng)計(jì)分析分為無監(jiān)督分析方法和有監(jiān)督分析方法。在代謝組學(xué)分析中無監(jiān)督分析有主成分分析(PCA)，而有監(jiān)督分析方法主要是偏最小二乘判別分析(PLS-DA)和正交偏最小二乘判別分析(OPLS-DA)。

　　因無外加人為因素，得到的PCA模型反映了代謝組數(shù)據(jù)的原始狀態(tài)，有利于掌握數(shù)據(jù)的整體情況并對數(shù)據(jù)從整體上進(jìn)行把握，并從中揭示出數(shù)據(jù)集中觀測數(shù)據(jù)的分組、趨勢以及離群。對明顯不同于大部分樣品的離群樣品，可加以甄別或剔除。另外，如果存在質(zhì)控樣品，PCA還可進(jìn)行質(zhì)控，如果質(zhì)控樣品分布點(diǎn)越靠近，則說明系統(tǒng)穩(wěn)定，檢測質(zhì)量沒有問題。

　　與PCA只有一個(gè)數(shù)據(jù)集不同，PLS-DA在分析時(shí)必須對樣品進(jìn)行指定并分組，這樣模型會(huì)自動(dòng)加上另外一個(gè)隱含的數(shù)據(jù)集Y。因?yàn)镻LS-DA在建模時(shí)對樣品進(jìn)行了指定和分組，所以能更大地區(qū)分組間差異，但這也導(dǎo)致數(shù)據(jù)的PLS-DA模型存在過擬合(overfitting)的問題, 會(huì)造成模型失真, 在實(shí)際數(shù)據(jù)分析時(shí)應(yīng)注意驗(yàn)證模型有效性和可靠性。

　　OPLS-DA使用正交信號(hào)校正技術(shù)，將X矩陣信息分解成與Y相關(guān)和不相關(guān)的兩類信息，然后過濾掉與分類無關(guān)的信息，相關(guān)的信息主要集中在第一個(gè)預(yù)測成分，有效減少模型的復(fù)雜性和增強(qiáng)模型的解釋能力，從而較大程度查看組間差異。OPLS-DA 得分圖，從橫坐標(biāo)的方向可以看到組間的差異;從縱坐標(biāo)上看出組內(nèi)的差異(組內(nèi)樣本間的差異)。

　　4. 代謝組學(xué)常用到的差異代謝產(chǎn)物的數(shù)據(jù)分析方法：

　　單變量分析方法是簡單常用的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析方法。在進(jìn)行兩組樣本間的差異代謝物分析時(shí)，常用的單變量分析方法包括差異倍數(shù)分析(Fold Change Analysis，F(xiàn)C Analysis)、T 檢驗(yàn)，以及綜合前兩種分析方法的火山圖(Volcano Plot)。

　　多元統(tǒng)計(jì)分析中無監(jiān)督分析有主成分分析(PCA)，而有監(jiān)督分析方法主要是偏最小二乘判別分析(PLS-DA)和正交偏最小二乘判別分析(OPLS-DA)。

　　VIP(Variable important in projection)是(O)PLS-DA模型變量的變量權(quán)重值，來衡量各代謝物的表達(dá)模式對各組樣本分類判別的影響強(qiáng)度和解釋能力，挖掘具有生物學(xué)意義的差異代謝物。

　　由于代謝組數(shù)據(jù)具有多維且某些變量間高度相關(guān)的特點(diǎn)，運(yùn)用傳統(tǒng)的單變量分析無法快速、充分、準(zhǔn)確地挖掘數(shù)據(jù)內(nèi)潛在的信息，因此一般采用多元統(tǒng)計(jì)分析方法，可以在較大程度保留原始信息的基礎(chǔ)上將高維復(fù)雜的數(shù)據(jù)進(jìn)行“簡化和降維”，建立可靠的數(shù)學(xué)模型對研究對象的代謝譜特點(diǎn)進(jìn)行歸納和總結(jié)。因此代謝組學(xué)推薦使用單維和多維的方法進(jìn)行結(jié)合，有助于我們從不同角度觀察數(shù)據(jù)，得出結(jié)論。所以選擇P值小于0.05與VIP值大于1作為常見的差異代謝物篩選標(biāo)準(zhǔn)。

　　5. 代謝組學(xué)中LC-MS與GC-MS數(shù)據(jù)的區(qū)別：

　　1)LC-MS根據(jù)電離方式不同，可分為電噴霧離子源(ESI)和大氣壓化學(xué)電離源(APCI) 2 種工作方式;GC-MS有電子轟擊電離(EI)、正化學(xué)電離(CI)、負(fù)化學(xué)電離(NCI)3種電離方法，其中前兩者較常用。

　　2)LC-MS是在正、負(fù)離子兩種模式下工作的，得到的數(shù)據(jù)形式也是不一樣的，而對代謝物的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析時(shí)也是分開的，但在代謝通路分析時(shí)(或者合并分析時(shí))，會(huì)將正負(fù)離子結(jié)合，有重復(fù)時(shí)選擇兩種模式中響應(yīng)較高的一個(gè)模式。

　　3)GC-MS通常只能在單一離子模式下工作，得到的數(shù)據(jù)模式非負(fù)即正，可根據(jù)實(shí)際的離子源進(jìn)行判斷，因此在分析時(shí)工作量就少了一半。再加上由于掃描離子范圍的差別，LC-MS獲得的數(shù)據(jù)量明顯更多。

　　相比于GC-MS，LC-MS一般無需衍生處理，分析平行性更好，更適合大規(guī)模樣本的分析。代謝數(shù)據(jù)有著典型的高維度、高噪聲等特性，并且存在數(shù)量級(jí)的差異，因此還需要對數(shù)據(jù)進(jìn)行樣本間和代謝物間的歸一化處理，以確保各樣本之間和代謝物之間可平行比較。歸一化的方法：內(nèi)標(biāo)歸一化、總峰面積歸一化和QC歸一化。簡單來說，就是對代謝數(shù)據(jù)集進(jìn)行一系列的數(shù)值處理，把數(shù)據(jù)拉到一個(gè)特定范圍里，轉(zhuǎn)換為可用于進(jìn)一步統(tǒng)計(jì)分析的可用形式。