近日，韓國(guó)大田的基礎(chǔ)科學(xué)研究所(Institute for Basic Science，IBS)基因組工程中心的研究團(tuán)隊(duì)開(kāi)發(fā)了一種可編程工具，并在Cell發(fā)表了“Targeted A-to-Gbase editing in human mitochondrial DNA with programmable deaminases”(圖1)的論文。研發(fā)人員將這個(gè)新的基因編輯平臺(tái)，稱為轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)子相關(guān)脫氨酶(TALED)。TALED是能夠在線粒體中進(jìn)行A到G堿基轉(zhuǎn)換的堿基編輯器。這一發(fā)現(xiàn)是長(zhǎng)達(dá)數(shù)十年治愈人類遺傳疾病之旅的結(jié)晶，為治愈多種線粒體遺傳病帶來(lái)了新的生機(jī)!TALED被認(rèn)為是基因編輯技術(shù)缺失的最后一塊拼圖。
從1968年第一次發(fā)現(xiàn)限制性內(nèi)切酶、1985年發(fā)明聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase Chain Reaction，PCR)到2013年突破CRISPR介導(dǎo)的基因組編輯技術(shù)，生物技術(shù)的每一次新突破都進(jìn)一步提高了人類研究DNA、設(shè)計(jì)生命藍(lán)圖的能力(圖2)。特別是最近開(kāi)發(fā)的“基因魔剪技術(shù)”——CRISPR-Cas，允許對(duì)活細(xì)胞進(jìn)行全面的基因組編輯。這為科學(xué)家們通過(guò)編輯基因組中的突變基因，用以治療以前根本無(wú)法治愈的遺傳疾病開(kāi)辟了新的可能性。
然而，雖然基因編輯技術(shù)在細(xì)胞核基因組取得了巨大成功，但科學(xué)家們?cè)诰庉嬀哂芯€粒體基因組方面一直沒(méi)有突破性成果。線粒體，即所謂的“細(xì)胞發(fā)電站”，是細(xì)胞中的微小細(xì)胞器，可作為能量產(chǎn)生工廠。由于它是能量代謝的重要細(xì)胞器，如果基因發(fā)生突變，就會(huì)導(dǎo)致身體出現(xiàn)與能量代謝相關(guān)的嚴(yán)重遺傳疾病。基因組工程中心主任KIM Jin-Soo解釋說(shuō)：“線粒體DNA的缺陷會(huì)導(dǎo)致人體出現(xiàn)一些非常嚴(yán)重的遺傳性疾病。例如，導(dǎo)致雙眼突然失明的Leber遺傳性視神經(jīng)病變(LHON)就是由線粒體DNA中的單點(diǎn)突變引起的。” 另一種與線粒體基因相關(guān)的疾病是線粒體腦肌病(MELAS)，這種疾病伴有乳酸酸中毒和中風(fēng)樣發(fā)作的癥狀，這種疾病會(huì)緩慢地破壞患者的大腦。有研究甚至表明，線粒體DNA異常也可能是阿爾茨海默病和肌肉萎縮癥等退行性疾病的誘因。 人類線粒體基因組屬母系遺傳，線粒體DNA中有90種已知的致病點(diǎn)突變，5000人中至少有1人會(huì)受影響。受線粒體傳遞方式的限制，許多現(xiàn)有的基因組編輯工具都無(wú)法使用。例如，CRISPR-Cas平臺(tái)并不適用于編輯線粒體中的突變，因?yàn)橐龑?dǎo)RNA本身無(wú)法進(jìn)入細(xì)胞器。
“另一個(gè)問(wèn)題是缺乏這些線粒體疾病的動(dòng)物模型。這是因?yàn)槟壳安豢赡茉O(shè)計(jì)出創(chuàng)建動(dòng)物模型所需的線粒體突變，”Kim補(bǔ)充說(shuō)。“缺乏相關(guān)動(dòng)物模型使得開(kāi)發(fā)和測(cè)試這些疾病的治療方法變得非常困難。”因此，開(kāi)發(fā)可靠的線粒體DNA編輯技術(shù)就成為基因組工程的前沿技術(shù)任務(wù)之一，多年來(lái)世界上最優(yōu)秀的一批科學(xué)家都在致力于這一技術(shù)的開(kāi)發(fā)，探索并試圖征服所有已知的遺傳疾病。
2020年，由哈佛大學(xué)布羅德研究所和麻省理工學(xué)院的David R. LIU領(lǐng)導(dǎo)的研究團(tuán)隊(duì)創(chuàng)建了一種新的堿基編輯器——名為DddA衍生的胞嘧啶堿基編輯器 (DdCBEs)，可以在線粒體中的DNA進(jìn)行C-to-T轉(zhuǎn)換。這是通過(guò)創(chuàng)建堿基編輯的新基因編輯DdCBEs技術(shù)實(shí)現(xiàn)的，該技術(shù)在不破壞DNA的情況下將單個(gè)核苷酸堿基轉(zhuǎn)換為另一個(gè)堿基。然而，這種技術(shù)也有其局限性：它限于C-to-T轉(zhuǎn)換，還限于TC基序，它的功能僅能做TC-TT堿基轉(zhuǎn)換器。這意味著它只能糾正90個(gè)確認(rèn)的致病性線粒體中的9個(gè)點(diǎn)突變。一直以來(lái)，人們甚至認(rèn)為線粒體DNA難以實(shí)現(xiàn)從A到G的轉(zhuǎn)換。 論文的第一作者CHO Sung-Ik說(shuō)：“我們開(kāi)始想辦法突破這些限制，并創(chuàng)建了一個(gè)名為TALED的新型基因編輯平臺(tái)，可以實(shí)現(xiàn)線粒體中A到G的轉(zhuǎn)換。TALED很大程度擴(kuò)大了線粒體基因組編輯的范圍，不僅可以為建立疾病模型做出重大貢獻(xiàn)，還可以為遺傳病治療貢獻(xiàn)不容小覷的力量。”這次研究的突破點(diǎn)在于，僅能在人類mtDNA 中進(jìn)行A到G轉(zhuǎn)換就可以糾正90種已知致病突變中的39種(占比43%)。
研究過(guò)程歷經(jīng)多次的試錯(cuò)，研究人員通過(guò)融合三個(gè)不同的組件創(chuàng)建了TALED。第一個(gè)組件是是轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)子(TALE)，它能夠呈現(xiàn)靶向DNA序列。第二個(gè)組件是TadA8e，一種促進(jìn)A到G轉(zhuǎn)換的腺嘌呤脫氨酶。第三個(gè)組件DddA tox是一種胞嘧啶脫氨酶，它使DNA更容易被TadA8e識(shí)別
TALED另一個(gè)神秘的功能是TadA8e能夠在具有雙鏈DNA(dsDNA)的線粒體中進(jìn)行A到G編輯，令人疑惑的地方在于TadA8e是一種已知僅對(duì)單鏈DNA具有特異性的蛋白質(zhì)。Kim教授對(duì)此也感到很意外：“以前沒(méi)有人想過(guò)使用TadA8e在線粒體中進(jìn)行堿基編輯，因?yàn)樗鼞?yīng)該只針對(duì)單鏈DNA。正是這種跳出教條框架的思維方式真正幫助我們發(fā)明了TALED。”研究人員對(duì)這個(gè)現(xiàn)象進(jìn)行推測(cè)，DddA tox允許通過(guò)瞬時(shí)展開(kāi)雙鏈來(lái)訪問(wèn)dsDNA。這個(gè)轉(zhuǎn)瞬即逝的時(shí)間窗口允許TadA8e這種超速效酶，快速進(jìn)行關(guān)鍵的編輯動(dòng)作。除了調(diào)整TALED的組件外，研究人員還開(kāi)發(fā)了一種能夠同時(shí)進(jìn)行A-to-G和C-to-T堿基編輯以及僅A-to-G堿基編輯的衍生技術(shù)。 研究人員還通過(guò)這項(xiàng)線粒體DNA編輯新技術(shù)來(lái)實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞衍生克隆。結(jié)果表明，TALED編輯技術(shù)既沒(méi)有細(xì)胞毒性，也不會(huì)導(dǎo)致線粒體DNA不穩(wěn)定。此外，在核DNA中沒(méi)有不良的脫靶編輯，線粒體DNA中的脫靶效應(yīng)也很少。
研究人員表示，下一步的目標(biāo)是通過(guò)提高編輯效率和特異性來(lái)進(jìn)一步改進(jìn)TALED這項(xiàng)技術(shù)，最終為糾正胚胎、胎兒、新生兒或成年患者中引起疾病的線粒體DNA突變鋪平道路。研究團(tuán)隊(duì)還專注于開(kāi)發(fā)適用于葉綠體DNA中A到G堿基編輯的TALED，葉綠體DNA編碼植物光合作用中的必需基因。 基礎(chǔ)科學(xué)研究所科學(xué)傳播者蘇威廉對(duì)TALED這項(xiàng)技術(shù)稱贊道：“我相信這一發(fā)現(xiàn)的意義可與2014年獲得諾貝爾獎(jiǎng)的藍(lán)色LED的發(fā)明相媲美。就像藍(lán)色LED是讓我們擁有高能效白光LED光源的最后一塊拼圖一樣，預(yù)計(jì)TALED將迎來(lái)基因組工程的新時(shí)代。”
